超分辨尺度上的成像质量评估方法

        哈尔滨工业大学赵唯淞/李浩宇团队，北京大学陈良怡团队及南开大学潘雷霆团队在Light: Science & Applications上在线发表论文Quantitatively mapping local quality of super-resolution microscopy by rolling Fourier ring correlation。他们提出可以利用滚动傅里叶环相关（rolling Fourier ring correlation, rFRC）方法来估计超分辨尺度下图像的像素级误差，采取改进的RSM方法分析较大的结构失真等错误，并将二者结合构成一种完善的超分辨显微图像重建质量评估方案（Pixel-level Analysis of Error Locations, PANEL）。该技术能够通用、无参考地生成像素级误差定量图，为生物分析精确定位可靠性较低的区域，判定分辨率最高可提升一个数量级，在超分辨图像质量评估上较其他方法展现出其精准稳定的优势。此外，团队提供了rFRC完备的MATLAB和Python开源代码，以及开箱即用的Fiji/ImageJ插件，使得其能够与光学超分辨成像技术结合，成为一种易于使用的本地质量评估工具。

     研究建立了rFRC与PANEL方案。使用rFRC对图像像素级的精修误差进行不确定度估计。对于由于模型失配产生的较大的结构丢失、失真等重建错误，则采取硬阈值分割改进后的RSM实现评估，与rFRC形成互补，其原理概述如图1所示。为充分有效利用数据，研究者首先对输入图像进行对称填充，并对之后逐块滚动傅里叶环相关计算的结果进行阈值分割，减小背景因素干扰。图像子块的FRC结果会分配给块区中心像素，实现超分辨尺度的不确定度估计。在rFRC图绘制完成后，将其与改进的RSM结果融合构成PANEL分析图。 

图1 | rFRC 映射和 PANEL 精确定位概述。(a) rFRC 图绘制的工作流程

步骤1，对称填充（灰色像素）的两个输入图像被裁剪为小子集以进行FRC计算。强度低于背景阈值的中心像素将被跳过；否则，执行下面的步骤2-5。步骤2-3，FRC计算，傅里叶域中的环相关运算（步骤2），以及FRC分辨率确定（步骤3）。步骤4，将获得的FRC分辨率分配给相应小子集的中心像素。步骤5，组装最终的rFRC图并用相应的颜色图进行渲染。(b) PANEL精确定位。为了突出显示可靠性较低的区域，rFRC图的值低于Otsu确定的阈值、归一化RSM值低于0.5的部分将被过滤。

研究者使用rFRC方法精确比较了不同单分子定位显微镜（Single-molecule localization microscopy, SMLM）恢复算法的性能，并在超分辨尺度下对不同重建图像进行有效融合，最大限度降低了潜在误差，实现了大视场单分子定位纳米级极限空间分辨成像。

       研究团队使用了SMLM仿真数据集（图2a），并采用极大似然估计（Maximum Likelihood Estimation, MLE）方法重建获得超分辨图像。通过应用rFRC方法（图2a中的第3列）对SR图像进行评估，准确揭示了不同发射器密度条件下重建中所有细微错误（白色箭头所指）。相比之下，RSM与SQUIRREL方法（图2a中第2列）均未能检测出细小的重建错误，且存在受随机强度波动影响的风险。此外，对于丝状物中缺失部分的较大失真（青色箭头，图2a），PANEL也精准完成评定，可见其具备精密和可靠的质量评估能力。此外，对于照明光强的不均（图2b）以及在同一视场内的离焦效应（图2c），rFRC与PANEL均能理想地判定出相应成像质量的差异。

图2 | 使用SMLM模拟进行系统验证

        (a) 均匀照明条件下（整体空间不变分子激活密度）的2D-SMLM模拟，每帧中具有高密度（“HD”，图a上）和低密度（“LD”，图a下）发射荧光团。青色和白色箭头分别表示RSM或rFRC图发现的错误。(b) 不均匀照明条件下的2D-SMLM模拟（中心照明强度高，向边缘降低）。(c) 非均匀离焦的2D-SMLM模拟（中心聚焦，边缘散焦）。从左到右：合并的最大似然估计（MLE）重建（绿色通道）和真值图像（红色通道）；完整的SQUIRREL结果（RSM对应于绿色通道，FRC图对应于洋红色通道）；分别来自奇数帧和偶数帧的两个超分辨重建的rFRC图；完整的PANEL图像（RSM对应于红色通道，rFRC映射到绿色通道）。比例尺：(a) 500 nm; (b, c) 1 μm。

        研究团队利用SMLM微管数据集对提出的评估方法进行了验证（图3）。rFRC成功绘制出这种微管分布密度不同引起的分辨率异质性（图3c）。进一步使用三维数据进行验证：一方面，其rFRC结果（图3d）表明核周结构密集区域出现显著的不确定度（图3e，3f）；另一方面，图像分辨率沿轴向尺寸波动，微管结构（图3g、3h）总体上最清晰的轴向平面位于焦平面，和理论经验一致。

图3 | rFRC评估定位显微镜的超分辨率图像      

       (a) COS-7细胞中用 Alexa Fluor 647 标记的α-微管蛋白的STORM重建结果（左）。(b) (a)的rFRC图。(c) STORM结果（亮绿色）和高斯平均rFRC图（shifted jet图）的合并视图，用于突出显示低质量区域。(d) COS-7细胞中用Alexa Fluor 647标记的α-微管蛋白的3D-STORM重建结果。(e) 图d的3D rFRC图。(f) (e)经过Otsu阈值分割后的PANEL结果。(g) (d)中白框部分的3D-STORM（左）和rFRC（右）对应的水平放大视图。(h) rFRC值随轴向位置的曲线。比例尺：(a, d) 5 μm; (g) 2 μm。